Enzymkinetik: Spaltung von Harnstoff mit Urease

Computergestützte Experimente - Messung: Leitfähigkeit
Enzymkinetik
Enzymatische Spaltung von Harnstoff mit Urease

Ziele: Ermittlung des Temperaturoptimums, der Michaeliskonstanten K_m und der maximalen Geschwindigkeit V_max, kompetitive Hemmung

Peter Keusch

Messwerterfassung mit dem Programm CHEMEX und dem Analog-Digital-Wandler CHEMBOX
IBK electronic + informatic

English version

Chemikalien:
Harnstoff (M = 60.06 g / mol)
Thioharnstoff (M = 76.13 g / mol)
Urease

Geräte und Glaswaren:
2 Magnetrührer
4 Magnetrührstäbchen
Rührstabentferner
Kristallisierschale d = 190 mm, h = 90 mm (für Wasserbad)
Kristallisierschale d 140 mm, h = 75 mm (für Wasserbad)
100 mL Dreihalsrundkolben mit 2 schrägen Seitenhälsen, Haupthals NS 29/32, Seitenhälse 14/23
6 Bechergläser 100 mL
1000 mL Messkolben
2 Kontaktthermometer
Temperatursonde
Leitfähigkeitsprüfer
Vollpipette 10 mL
Vollpipette 100 mL
2 Peleusbälle

Gefahren und Sicherheitsmaßnahmen:

Thioharnstoff erweist sich als gesundheitsschädlich beim Einatmen, Verschlucken und bei Berührung mit der Haut. Irreversibler Schaden möglich. Giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern lägerfristig schädliche Wirkungen haben. Kann beim Menschen vermutlich Krebs erzeugen und ist möglicherweise fruchtschädigend.

Haut- und Augenkontakt vermeiden. Schutzbrille, Schutzhandschuhe und gute Raumdurchlüftung erforderlich. Substanz darf nicht in die Kanalisation gelangen.

Theoretische Grundlagen:

Harnstoff wird durch das Enzym Urease in Ammoniak und Kohlendioxid gespalten. Folglich kann die Reaktion durch Leitfähigkeitsmessung verfolgt werden. Die Leitfähigkeit is proportional zur Konzentration der bei der Reaktion entstehenden Ionen.

Kinetische Gleichungen (Download PDF-Datei)

Vorbereitung der Lösungen:

Herstellung der Harnstofflösungen: 1.2 g Harnstoff werden in einen 1000 mL Messkolben gegeben und dieser bis zur Eichmarke mit dest. Wasser aufgefüllt. Die Konzentration der Harnstofflösung beträgt 2 · 10^-2 mol / L. Durch entsprechendes Verdünnen der Stammlösung werden 1.5 · 10^-2, 10^-2, 7 · 10^-3 und 4 · 10^-3 molare Lösungen hergestellt.

Herstellung der Ureasesuspension: In einem 100 mL Becherglas werden 100 mg Urease unter Rühren in 50 mL Wasser soweit wie nöglich gelöst. Da das Enzym bei 40 °C zu denaturieren beginnt, sollte man bei höheren Reaktionstemperaturen die Ureasesuspension jeweils frisch herstellen.

Abb. 1: Veruchsaufbau

Experiment 1: Ermittlung des Temperaturoptimums und der Aktivierungsenergie

Versuchsdurchführung:

Neben dem Leitfähigkeitsprüfer (1) ist auch eine Temperatursonde (2) über den Eingang Sensor1 an die CHEMBOX angeschlossen (Abb. 1).

Im Programm 'Chemex' wird die Messdauer mit 120 s und der Messbereich mit 0 bis 200 ms fixiert.In ein Wasserbad taucht ein Dreihalskolben. Der Kolben wird mit 100 mL Harnstofflösung ( c_S = 10^-2 mol / L ) beschickt. Die beiden Sensoren werden so justiert, dass ihr Ende zumindest 1 cm in die Lösung eintaucht. Mit Hilfe des Magnetrührers, eines Kontaktthermometers und des Wasserbades bringt man die Harnstofflösung auf die gewünschte Reaktionstemperatur (20, 30, 40, 50, 60 °C). Auch die Ureasesuspension wird in einem Becherglas auf die entsprechende Temperatur erwärmt (Abb. 1). Nach Temperaturkonstanz werden in die Harnstofflösung 10 mL Ureaselösung pipettiert und die Messung sofort gestartet. Ab einer Reaktionstemperatur von 40 °C ist eine frisch bereitete Ureasesuspension zu verwenden.

Die Änderung der Leitfähigkeit kann auf dem Messbildschirm verfolgt werden (Abb. 2).

Abb. 2: Messbildschirm Leitfähigkeitskurve (T = 20 °C c_S = 10^-2 mol / L)

Versuchsauswertung:

Die Messdaten werden in Microsoft Excel importiert und hier ausgewertet.

Temperatur

Abb. 3: Leitfähigkeitskurven (c_S = 10^-2 mol / L)
T = 20°C (1) 30 °C (2) 40 °C (3) 50 °C (4) und 60 °C (5)

Temperatur [ °C ]	20	30	40	50	60
k [ mS · s^-1 ]	0.000793	0.001515	0.002481	0.003865	0.003097
v [ mS · min^-1 ]	0.04758	0.0909	0.14886	0.2319	0.18582

Tab. 1: Reaktionsgeschwindigkeit v

Temperaturoptimum

Abb. 4: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Temperatur (c_S = 10^-2 mol / L)

Für den Tenperaturbereich 30 - 50 °C (Tab. 1) beträgt die Aktivierungsenergie 38.1 kJ · mol^-1 und die Aktivierungsenthalpie 35.5 kJ · mol^-1. Die Aktivierungsparameter errechnen sich gemäß Arrhenius - bzw. Eyring - Gleichung aus der Steigung m der jeweiligen Geraden in den Auftragungen von lnk bzw. lnk/T gegen 1/T (Abb. 5):

E _a = - m · R = 4588,4 · 8.3144 = 38.1 kJ · mol^-1
DH ^‡ = 4275,5 · 8.3144 = 35.5 kJ · mol^-1

Abb. 5: ARRHENIUS- (1) und EYRING-Plot (2)

Deutung des Versuchsergebnisses:

Auch bei enzymkatalysierten Reaktionen wird die Reaktionsgeschwindigkeit mit steigender Temperatur erhöht. Allerdings nimmt nach Erreichen eines Temperaturoptimums die Reaktionsgeschwindigkeit infolge Denaturierung des Enzyms ab. Menschliche Enzyme besitzen ein Temperaturoptimum, das zumeist bei 37 °C (Körpertemperatur) angesiedelt ist. Das vorliegende Experiment zeigt, dass das Temperaturoptimum der Urease bei etwa 50 °C liegt. Über 50 °C beginnt das Enzym zu denaturieren. Die Enzymaktivität wird eingeschränkt.

Für die nicht katalysierte Spaltung von Harnstoff in Wasser verläuft äußerst langsam und benötigt eine Aktivierungsenergie von etwa 130 kJ, während sich in Gegenwart von gelöster Urease die Aktivierungsenergie auf etwa
42 kJ erniedrigt.

Experiment 2: Ermittlung der Michaeliskonstanten K_m und der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit v_max

Um die kinetischen Parameter K_m and V_max zu ermitteln ist es notwendig die Geschwindigkeit der Enzymreaktion bei verschiedenen Substratkonzentrationen zu messen. Dabei werden Enzymkonzentration und die übrigen Bedingungen konstant gehalten.

Versuchsdurchführung:

100 mL Harnstofflösung werden mit 10 mL Ureasesuspension bei 40 °C und 50 °C umgesetzt. Es kommen folgende Substratkonzentrationen zum Einsatz: c_S = 4 · 10^-3, 7 · 10^-3 und 10^-2 mol / L.

Versuchsauswertung:

Abb. 6: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration (T = 50 °C)
c_S = 4 · 10^-3 (1) 7 · 10^-3 (2) 10^-2 mol / L (3)

c_S [ mol · L^-1 ] 4 · 10^-3 7 · 10^-3 10^-2
k [ mS · s^-1 ] 0.001868 0.002934 0.003865
v [ mS · min^-1 ] 0.11208 0.17604 0.2319
Tab. 2: Reaktionsgeschwindigkeit v bei 50 °C

c_S [ mol · L^-1 ] 4 · 10^-3 7 · 10^-3 10^-2
k [ mS · s^-1 ] 0.001214 0.001934 0.002481
v [ mS · min^-1 ] 0.07284 0.11658 0.14886
Tab. 3: Reaktionsgeschwindigkeit v bei 40 °C

Gemäß Gleichung (11) Kinetische Gleichungen (Download PDF-Datei) erfolgt die Auftragung von 1 / v gegen 1 / c_S (Abb. 7). Trägt man die Geschwindigkeitkonstanten k und die entsprechenden Substratkonzentrationen c_S in die Tabelle der Excel-Datei Lineweaver-Burk (Download) ein (Tab. 4), so werden die Werte für die Michaeliskonstante K_m und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit v_max errechnet.

Tab. 4: Excel Datei Ermittlung von K_m und v_max

Abb. 7: Auftragung nach Lineweaver-Burk T = 50 °C (1) T = 40 °C (2)

Für die Michaeliskonstante K_m ergab sich ein Wert von 2.41 · 10^-2 [ mol · L^-1 ] (Lit.: 2.5 · 10^-2).
Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit v_max beträgt bei 40 °C 0.5118 [ mS · min^-1 ] bzw. 0.7868 [ mS · min^-1 ] bei 50 °C.

Die Michaeliskonstante K_m gibt den Wert für die Substratkonzentration an, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit v der halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit v_max / 2 entspricht ( Abb. 8). Dementsprechend ermöglicht die Kenntnis von K_m gemäß ƒ_ES = v / v_max die Ermittlung der prozentualen Anteile der besetzten Zentren für die einzelnen Substratkonzentrationen ( Abb. 9).

c_S [ mol · L^-1 ]	4 · 10^-3	7 · 10^-3	10^-2	1.5 · 10^-2	2 · 10^-2	2.41 · 10^-2 = K_m
v [ mS · min^-1 ]	0.11208	0.17604	0.2319	0.30174	0.37148	0.3934
v / v_max	0.14245	0.22374	0.29474	0.38350	0.47214	0.5

Tab. 4: Anteile der besetzten aktiven Zentren ƒ_ES = v / v_max (T = 50 °C)

Abb. 8: Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Substratkonzentration (T = 50 °C)

besetzte Zentren

Abb. 9: Prozentuale Anteile der besetzten aktiven Zentren ƒ_ES = v / v_max    (T = 50 °C)

Experiment 3: Kompetitive Hemmung mit Thioharnstoff

Versuchsdurchführung:

Um die kompetitive Hemmung zu erfassen, werden 100 mL einer Lösung eingesetzt, die sowohl bezüglich der Harnstoffkonzentration als auch bezüglich der Thioharnstoffkonzentratin äquimolar ist. Auch bei diesem Experiment kommen die Konzentrationen c_S = 4 · 10^-3, 7 · 10^-3 und 10^-2 mol / L zum Einsatz. Jeweils 50 mL der Lösungen von Harnstoff und Thio-harnstoff entsprechender Konzentration werden miteinander vermischt und mit 10 mL Ureasesuspension versetzt.

Versuchsauswertung:

Abb. 10: Kompetitive Hemmung     Spaltung von Harnstoff bei Gegenwart von Thioharnstoff (T = 50°C)
c_S = 4 · 10^-3 (1)      7 · 10^-3 (2)      10^-2 mol / L (3)

Abb. 11: Auftragung nach Lineweaver-Burk Kompetitive Hemmung
1: Harnstoff 2: Harnstoff + Thioharnstoff

Harnstoff und Thioharnstoff konkurrieren um das aktive Zentrum. Während v_max konstant bleibt ( v_max' = v_max ) , erfährt der Wert für K_m bei Anwesenheit von Thioharnstoff eine Verdoppelung. Die Affinität des Enzyms zum Harnstoff ist um die Hälfte reduziert.

Hinweis:
Computergestützte Experimente Enzymkinetik: Enzymatische Spaltung von Wasserstoffperoxid mit Katalase
Demonstrationsexperiment auf Video Spaltung von Harnstoff mit Urease

Liste der Chembox-Experimente