Kinetik: Enzymatische Spaltung von Wasserstoffperoxid

Computergestützte Experimente - Messung: Volumen
Enzymkinetik
Enzymatische Spaltung von Wasserstoffperoxid mit Katalase

Ziel: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Temperatur und von der Enzym- bzw. Substratkonzentration,
Nachweis einer Reaktion erster Ordnung

Peter Keusch

Messwerterfassung mit dem Programm CASSY^® Lab und dem Analog-Digital-Wandler Sensor-CASSY - LEYBOLD DIDACTIC

English version

Chemikalien:
Wasserstoffperoxid 30 %
Katalase aus Rinderleber, kristalline Suspension in Wasser (Merck)

Geräte und Glaswaren:
Magnetrührer
2 Magnetrührstäbchen
Rührstabentferner
Kristallisierschale d = 190 mm, h = 90 mm (für Wasserbad)
Kontaktthermometer
100 mL Dreihalsrundkolben mit 2 schrägen Seitenhälsen, Haupthals NS 29/32, Seitenhälse 14/23
Thermometer 0 - 50 °C (Auflösung: 0.1 °C)
Tropftrichter mit Druckausgleichsrohr NS 14
Übergangsstück NS 29 mit Silikonschlauch
Kolbenprober 100 mL
Mikropipette
Vollpipette 3 mL
Vollpipette 30 mL
2 Peleusbälle
Messumformer mit Silikonschlauch und Gewicht
Verbindungskabel
Entsorgungskanister

Gefahren und Sicherheitsmaßnahmen:

Wasserstoffperoxid 30 % entwickelt eine starke Ätzwirkung auf Haut, Schleimhäuten und Augen Verschlucken führt zu starken Leibschmerzen sowie Übelkeit und Erbrechen.

Schutzbrille, Schutzhandschuhe und gute Raumdurchlüftung erforderlich.

Theoretische Grundlagen:

Wasserstoffperoxid wird durch das Enzym Katalase unter Bildung von Wasser und Sauerstoff zersetzt:

Die enzymatische Spaltung von H₂O₂ kann durch Messung des entstehenden Sauerstoffvolumens verfolgt werden.

Volumenmessung

Für die Messung von Gasvolumina, die bei chemischen Reaktionen anfallen, kommt ein Kolbenprober zum Einsatz (Abb. 1). Entstehende Gase setzen den Kolben solange in Bewegung, bis der entsprechende Druckausgleich erreicht ist. Um den Reibungswiderstand zu kompensieren, wird am Kolben, der mit Graphitgleitmittel benetzt ist, ein Gewicht befestigt, das Reibungskraft entgegen wirkt. Der Kolbenweg wird über eine Silikonschnur an einen Drehwiderstand übertragen und somit die Bewegung des Kolbens mit Hilfe eines "Messumformers" in elektrische Signale umgewandelt (siehe Katalytischeder Zersetzung von Wasserstoffperoxid mit Chromat / Dichromat).

Abb. 1: Versuchsaufbau

Anpassung des Programms

Der Messumformer, an den eine konstante Gleichspannung von 5 Volt angelegt wird, ist an den Input A des Interface angeschlossen.

Über F5 gelangt man zum Fenster 'Einstellungen' in dem man die Registerkarte Cassy wählt. Input A erscheint markiert und muß angeklickt werden. Es öffnet sich das Fenster 'Einstellungen Sensoreingang'. Unter Messgröße wird Spannung UA1 gewählt, und unter Messbereich 3 V .. 3 V. Die Momentanwerte werden aktiviert. Klickt man das Feld Korrigieren an, öffnet sich das Fenster Messwerte korrigieren . Um die Messung zu kalibrieren, setzt man zunächst den Kolben des Kolbenprobers auf 0 ml und achtet darauf, dass der Drehwiderstand des Messumwandlers am Anschlag in Richtung gegen den Uhrzeigersinn ist. Nun gibt man als Sollwert 0V ein und klickt Offset korrigieren. Anschließend wird der Kolben des Kolbenprobers bis zur Marke 100 ml herausgezogen. Der Wegaufnehmer ändert entsprechend seinen Innenwiderstand. Es wird der Sollwert 1V eingegeben und Faktor korrigieren angeklickt. Nun kann das Fenster geschlossen werden. Die Kalibrierung ist abgeschlossen. Auch das Fenster 'Einstellungen Sensoreingang' wird geschlossen. Klickt man das Feld Messparameter anzeigen kann automatische Aufnahme und als Intervall 1 s gewählt werden.

Cassy-Lab misst Spannungswerte, die der Volumenzunahme im Kolbenprober entsprechen. Um die Volumenveränderung auf dem Bildschirm (Abb. 2) zu verfolgen, können die Spannungsmesswerte über eine Formel in Volumenwerte umgerechnet werden. Hierzu wählt man wiederum im Fenster 'Einstellungen' die Registerkarte Parameter/Formel/FFT. Zunächst wird Neue Größen angeklickt und unter Formel UA1*100 (1 Volt entspricht 100 mL) eingegeben. Als Symbol wird V für Volumen gesetzt und als entsprechende Einheit ml gewählt. Alle anderen Felder bleiben unverändert.

Experiment 1: Motivationsexperiment - Zersetzung von Wasserstoffperoxid mit Gras

Versuchsdurchführung:

Man legt im Dreihalskolben etwas fisches Gras vor und bedeckt dieses mit 30 mL Wasser. Der Troftrichter, gefüllt mit 3 mL 6 %iger Wasserstoffperoxidlösung, wird mit einen Stopfen verschlossen und der Rührer eingeschaltet. Der Hahn des Tropftrichters wird geöffnet und die Peroxidlösung aus dem Trichter gelassen. Gleichzeitig wird der Hahm der Gasspritze geöffnet. Sobald die Zugabe von Wasserstoffperoxidlösung beendet ist, wird die Messung über die 'Stoppuhr' bzw. F9 gestartet.
In wenigen Sekunden beginnt eine Gasentwicklung und der Kolben der Gasspritze setzt sich in Bewegung. Die Volumenänderung des sich entwickelnden Sauerstoffs kann auf dem Messbildschirm verfolgt werden (Abb. 2).

Abb. 2: Messbildschirm - Zersetzung von Wasserstoffperoxid mit Gras
Spannungsänderung (schwarz)     Volumenänderung Sauerstoff (rot)

Abb. 3: Dreidimensionale Struktur der Katalase
(vier Hämgruppen mit dreiwertigem Eisen)

Experiment 2: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Temperatur

Versuchsdurchführung:

Man legt pro Experiment 30 mL Wasser im Dreihalskolben vor, fügt 0.01 mL der Katalase-Suspension hinzu und temperiert mit Hilfe des Wasserbades. Nach 15 minütigem Thermostatisieren ist das Wasser im Kolben auf die Temperatur des Wasserbades gebracht.
Nach Zugabe von 3 mL 2 %ige Wasserstoffperoxidlösung wird die Temperatur bis auf 0.1 °C genau abgelesen und die Messung gestartet.

Versuchsauswertung:

Auswertung der bei der Zersetzung von Wasserstoffperoxid mit CASSY^® Lab erfassten Messdaten in Microsoft Excel

Die Cassy-Messwertetabelle kann leicht in ein Tabellenkalkulationsprogramm, wie z.B. in MS Excel, übertragen werden. Dort bestehen weitaus größere Möglichkeiten, die Daten auszuwerten und ansprechend graphisch darzustellen. Die Cassy-Messwertetabelle muss lediglich mit der rechten Maustaste angeklickt werden, dann die Option Tabelle Kopieren gewählt werden und in einem anderen Programm eingefügt werden. Mit der graphischen Darstellung unter Cassy kann ebenso verfahren werden.

Tab. 1: Messwerte V (t)     Konvertierung gemäß y = V (t) / V_¥ · n (H₂O₂) / 2

Abb. 4: Auftragung der Stoffmenge n (O₂) gegen t     c_S = 0.59 · 10^-1 mol / L
21°C (1)    32.4°C (2)    52°C (3)

Experiment 3: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Katalasekonzentration

Versuchsdurchführung:

Die Versuchsdurchführung erfolgt wie oben beschrieben. Zum Einsatz kommen 0.005, 0.010 und 0.020 mL Katalasesuspension und 3 mL 6 %ige Wasserstoffperoxidlösung. Die Reaktionstemperatur beträgt 21 °C.

Versuchsauswertung:

Abb. 5: Auftragung der Stoffmenge n(O₂) gegen t    T = 21 °C     c_S = 1.77 · 10^-1 mol / L
0.005 mL (1)     0.010 mL (2)     0.020 mL (3)   Katalasesuspension

Experiment 4: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration und Nachweis einer Reaktion erster Ordnung

Versuchsdurchführung:

Die Versuchsdurchführung erfolgt wie oben beschrieben. Zum Einsatz kommen 3 ml 2 %ige, 4 %ige und 6 %ige Wasserstoffperoxidlösung und 0.010 mL Katalasesuspension. Die Reaktionstemperatur beträgt 23.9 °C.

Versuchsauswertung:

Nach Fertigung des Diagramms der Auftragung von V gegen t (Abb. 6) erstellt man im Tabellenblatt (Tab. 2) einen Block, der die Auftragung von
- ln(1- (V_¥/ V_t))

gegen t und somit entsprechend Gleichung (7) Kinetische Gleichungen (Download PDF-Datei) die Ermittlung der Geschwindigkeitskonstanten ermöglicht (Abb. 7).

Tab. 2: Messwerte V(t), Konvertierung gemäß y = ln(1 - (V_t / V_¥))

Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration

Abb. 6: Auftragung von V gegen t      T = 23.9 °C
c_S = 0.59 · 10^-1 mol / L (1)      c_S = 1.18 · 10^-1 mol / L (2)      c_S = 1.77 · 10^-1 mol / L (3)

Nachweis einer Reaktion erster Ordnung

Abb. 7: Ermittlung der Geschwindigkeitskonstante     T = 23.9 °C
c_S = 0.59 · 10^-1 mol / L (1)      c_S = 1.18 · 10^-1 mol / L (2)      c_S = 1.77 · 10^-1 mol / L (3)
y = ln(1 - (V_t / V_¥))

Diskussion:

· Die Zersetzung des Wasserstoffperoxids stellt in wässeriger Lösung eine sehr langsame Reaktion dar, die durch verschiedene Katalysatoren beschleunigt wird. Die enzymatische Spaltung mit Katalase gehorcht einer Reaktion nullter Ordnung. Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt lediglich von der Enzymkonzentration ab. Bei niedriger Substratkonzentration, wie im vorliegenden Fall, ist die Reaktion erster Ordnung.

· Die Reaktionsgeschwindigkeit der enymatischen Zersetzung von Wasserstoffperoxid nimmt im untersuchten Temperaturbereich mit steigender Temperatur zu.

· Zwischen der Katalasekonzentration und der Reaktionsgeschwindigkeit besteht ein linearer Zusammenhang.

· Mögliche Inhibitoren für die Katalase sind Cyanid, Phenol, Azid und Harnstoff. Alle diese Hemmstoffe wirken kompetitiv und werden an die Katalase direkt gebunden. Sie verringern so die katalytische Wirksamkeit des Enzyms. Ein weitere Inhibitor ist Wasserstoffperoxid selbst. In hoher Konzentration vergiftet es das Enzymsystem. Bis zu einer Konzentration von 0.4 M H₂O₂ ist die Reaktionsgeschwindigkeit proportional zur Substratkonzentration. Bei höherer H₂O₂ - Konzentration fällt die Reaktionsgeschwindigkeit
stark ab.

Hinweise:
Catalase Kinetics
Demonstrationsexperiment auf Video Zersetzung von Wasserstoffperoxid mit Katalase

Liste der CASSY-Experimente