Spaltung von Harnstoff mit Urease

Demonstrationsexperiment auf Video

Spaltung von Harnstoff mit Urease

Lernziele: Enymkatalyse, Substratspezität

Peter Keusch

English version

Chemikalien:

Harnstoff (M = 60.06 g / mol)
Thioharnstoff (M = 76.13 g / mol )
Urease

Phenolphthalein 1 % in Ethanol (Merck)

Glaswaren:
3 Reagierkelche 350 mL
3 Glasrührstäbe
3 Schnappdeckelgläser 20 mL
3 Schnappdeckelgläser 10 mL

Gefahren und Sicherheitsmaßnahmen:

Thioharnstoff erweist sich als gesundheitsschädlich beim Einatmen, Verschlucken und bei Berührung mit der Haut. Irreversibler Schaden möglich. Giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern lägerfristig schädliche Wirkungen haben. Kann beim Menschen vermutlich Krebs erzeugen und ist möglicherweise fruchtschädigend.

Haut- und Augenkontakt vermeiden. Schutzbrille, Schutzhandschuhe und gute Raumdurchlüftung erforderlich. Substanz darf nicht in die Kanalisation gelangen.

Vorbereitung der Lösungen

Harnstoff-Lösung: 2.4 g Harnstoff in 200 mL dest. H₂0
Harnstoff/Thioharnstoff - Lösung: 2.4 g Harnstoff + 3 g Thioharnstoff in 200 mL dest. H₂0
Thioharnstoff - Lösung: 3 g Thioharnstoff in 200 mL dest. H₂0
Urease - Suspension: 60 mg Urease in 30 mL dest. H₂0

Versuchsdurchführung:

Die drei Reagierkelche werden wie folgt versorgt:
Reagierkelch A: 200 mL Harnstoff - Lösung
Reagierkelch B: 200 mL Harnstoff / Thioharnstoff - Lösung
Reagierkelch C: 200 mL Thioharnstoff-Lösung

Jeweils 2 mL der alkoholischen Phenolphtaleinlösung und 10 ml der Urease - Suspension werden unter Rühren zu den vorgelegten Lösungen gegeben.

Versuchsergebnis:

Die Harnstofflösung in Reagierkelch A färbt sich rot. Die Farbe wird rasch intensiver.

Die Harnstoff/Thioharnstoff-Lösung in Reagierkelch B nimmt erst nach einigen Minuten eine rote Farbe an.

Die wässerige Lösung von Thioharnstoff in Reagierkelch C bleibt farblos

Videoclip (Download RealPlayer .rm-Datei)

Deutung des Versuchsergebnisses:

Urease, ein Nickel enthaltendes Enzym katalysiert den Abbau von Harnstoff zu Ammoniak und Carbaminsäure, die ihrerseits rasch in Ammoniak und Kohlendioxid zerfällt.

Die Kristallstrukur des aktiven Zentrums von Urease enthält wahrscheinlich zwei einfach koordinierte Wassermoleküle und eine überbrückende OH-Gruppe. Die Bindungsstelle des Enzyms ist perfekt für Harnstoff konstruiert; das erklärt die hohe Spezifizität der Urease.

Abb.1: Aktives Zentrum der Urease

Der vorgeschlagene Mechanismus (Abb. 2) besteht aus einem kooperativen Zusammenspiel der Ni-Ionen.

· Ein Ni-Ion (Ni1) wirkt als Lewis-Säure. Das Metallion polarisiert die Carbonylgruppe des Harnstoffmoleküls und aktiviert sie für einen nukleophilen Angriff. Zwei Moleküle H₂O werden dabei verdrängt. Das andere Ni-Ion (Ni2) bindet ein Hydroxidion.
· Das OH^--Ion greift am positiv ploarisierten Carbonyl-C-Atom des Harnstoffmoleküls an. Eine der beiden NH₂-Gruppen des Harnstoffs wird protoniert. Es wird postuliert, dass Histidin als Säure fungiert.

Carbaminsäure und Ammoniak sind die Reaktionsprodukte.

Abb.2: Mechanismus der Harnstoff-Spaltung

Die Carbaminsäure zerfällt spontan in Ammoniak und Kohlendioxid (1)

Die in wässeriger Lösung vorliegenden Hydroxidionen sind für das Umschlagen des Indikators verantwortlich.

Urease ist substratspezifisch. Das Enzym kann lediglich Harnstoff, nicht jedoch den strukturähnlichen Thioharnstoff spalten.

Wird eine Lösung von Harnstoff und Thioharnstoff mit Urease versetzt, so ist die Aktivität des Enzyms stark herabgesetzt. Wie Harnstoff, so kann auch der strukturähnliche Thioharnstoff an das aktive Zentrum des Enzyms gebunden werden. Somit ist das aktive Zentrum zeitweilig durch das falsche Substrat' blockiert. Man spricht von einer kompetitiven Hemmung, da Substrat und Inhibitor in nahezu gleichem Maße um das aktive Zentrum konkurrieren. Durch Erhöhung der Substratkonzentration kann der Hemmstoff verdrängt und die kompetitive Hemmung wieder rückgängig gemacht werden.

Abb.2 entnommen aus Bioanorganische Chemie I (Eisen, Molybdän und Nickel (Uni Hamburg)

Liste der Experimente